Figlia di Roberto e di Ingrid Bergman, nata a Roma, si trasferisce a diciannove anni negli Stati Uniti, dove lavora come corrispondente per la Rai. Alla carriera di modella e di testimonial di importanti aziende di cosmetici, affianca presto quella di attrice, esordendo nel 1976 nel film Nina di Vincente Minnelli, e affermandosi nel 1979 ne Il prato dei fratelli Taviani. Nel 1985 recita ne Il sole a mezzanotte, il suo primo film americano. La notorietà cinematografica arriva nel 1986, quando interpreta il personaggio di Dorothy Vallens nel film Velluto blu di David Lynch. Altri ruoli di successo sono quelli nei film Cugini (1989), Cuore selvaggio (1990), La morte ti fa bella (1992), The Innocent (1993), Fearless - Senza paura (1993), Fratelli (1997), Roger Dodger (2002), Two lovers (2008), La solitudine dei numeri primi (2010), L'era legale (2012), Joy (2015). Ha pubblicato tre libri: l'autobiografico Some of me (1997), Looking at Me (on pictures and photographers) (2002) e In the name of the Father, the Daughter and the Holy Spirits: Remembering Roberto Rossellini (Nel nome del padre, della figlia e degli spiriti santi, 2006), soggetto e sceneggiatura del cortometraggio Mio padre ha cento anni, diretto da Guy Maddin. Nel 2008 ha girato Green Porno, una serie di cortometraggi sulla vita sessuale degli insetti, cui hanno fatto seguito i corti Animals distract me (2011) e Mammas (2013). Isabella Rossellini è anche direttrice della Howard Gilman Foundation, un'istituzione impegnata nella salvaguardia della natura e nella conservazione dell'arte, della fotografia e della danza.