Figlia di Roberto Rossellini e Ingrid Bergman, Isabella Rossellini è nata con la sorella gemella Isotta a Roma il 18 giugno 1952. A diciannove anni, si è trasferita negli Stati Uniti, dove ha studiato al Finch College e alla New School for Social Research. Tornata in Italia, è stata corrispondente della Rai da New York. Ha lavorato come modella per le più importanti riviste americane, prima del debutto cinematografico nel film di Vincente Minnelli Nina (1976), interpretato da Ingrid Bergman e Liza Minnelli.

Nel 1979, Isabella Rossellini è protagonista, con Michele Placido, del film di Paolo e Vittorio Taviani Il prato. Nello stesso anno sposa Martin Scorsese. All'inizio degli anni Ottanta, firma un contratto con la Lancôme e ne diventa testimonial. Dopo il divorzio da Scorsese, nel 1983, l'attrice si lega al ballerino Mikhail Baryshnikov, protagonista con lei del film di Taylor Hackford Il sole a mezzanotte (1985). Nel 1986 interpreta Dorothy Vallens in Velluto blu di David Lynch e nel 1990 è con Nicolas Cage in Cuore selvaggio. Dopo un piccolo ruolo nel film di Robert Zemeckis La morte ti fa bella (1992), è con Jeff Bridges e Rosie Perez in Fearless - Senza paura (1993) di Peter Weir. L'anno successivo, appare nel western di Lawrence Kasdan Wyatt Earp ed è a fianco di Gary Oldman in Amata immortale.

Nel 1996, ha poi interpretato Clara in Fratelli di Abel Ferrara, insieme a Christopher Walken e Chris Penn. Nel 2000 comincia la sua collaborazione con il regista canadese Guy Maddin per il quale recita in La canzone più triste del mondo, storia di una baronessa produttrice di birra in Canada negli anni Trenta. Sempre con Maddin realizza un cortometraggio a cento anni dalla nascita di suo padre Roberto Rossellini, My Father Is 100 Years Old.

È autrice dei libri: "Some of Me", la sua autobiografia scritta nel 1997; "Looking at Me (on Pictures and Photographers, 2002)" e "In the Name of the Father, the Daughter and the Holy Spirits: Remembering Roberto Rossellini" (2006), tradotto in italiano con il titolo "Nel nome del padre, della figlia e degli spiriti santi".

In questi ultimi anni ha recitato in King of the Corner di Peter Riegert, nel 2004, e l'anno successivo in Height di Chris Terri. Nel 2006 è la volta di The Architect di Matt Tauber ed Infamous - Una pessima reputazione di Douglas McGrath, poi, nel 2008 Un marito di troppo di Griffin Dunne e Two Lovers di James Gray. Nel 2010 interpreta La solitudine dei numeri primi di Saverio Costanzo. L'anno successivo è nel cast di Late Bloomers di Julie Gavras, Pollo alle prugne dell'illustratrice e regista iraniana Marjane Satrapi e Vincent Paronnaud, Keyhole di Guy Maddin e L'era legale di Enrico Caria. Il 2012 inizia con Silent Life di Vladislav Kozlov e Deauville di Miguel Cruz Carretero. Per il Sundance Channel (il canale televisivo di Robert Redford) ha realizzato due serie di cortometraggi (Green Porno e Seduce Me) dedicati alla vita sessuale degli insetti e degli animali marini.

Nel 2011 è stata la Presidente della Giuria del 61° Festival Internazionale del Film di Berlino.